工程化的“迷你”CRISPR 基因编辑系统——更容易输送到人类细胞进行基因治疗

斯坦福大学的研究人员设计了一种采用 CRISPR 技术的新型微型系统，它应该更容易输送到人体细胞中。

生物工程师重新使用了“非工作”CRISPR 系统来制作更小的基因组工程工具。 它的小尺寸应该有助于进入细胞、组织和人体进行基因治疗。

CRISPR 基因编辑的一个常见类比是它像分子剪刀一样工作，剪下特定部分 脱氧核糖核酸. 斯坦福大学生物工程助理教授 Stanley Key 喜欢这个比喻，但认为是时候将 CRISPR 重新想象为瑞士军刀了。

“CRISPR 技术可以像修剪器一样简单，也可以像调节器、编辑器、标签或成像那样更先进，”齐说，他也是斯​​坦福大学医学院化学和系统生物学助理教授、研究员在斯坦福大学化学与健康研究所。“这个令人兴奋的领域出现了许多应用。”

然而，许多不同的 CRISPR 系统用于或正在临床测试用于眼、肝和脑疾病基因治疗的范围仍然有限，因为它们都具有相同的缺陷：它们太大，因此难以转移进入细胞、组织或生物体。

在 9 月 3 日发表的一篇论文中 分子细胞Qi 和他的合作者宣布了他们认为 CRISPR 向前迈出的一大步： 小型的 CRISPR系统。 而常用的 CRISPR 系统——像 Cas9 和 Cas12a 这样的名称表示 CRISPR 相关 Cas 蛋白的不同版本——由大约 1,000 到 1,500 氨基酸，“CasMINI”有529个。

在他们的实验中，研究人员证实 CasMINI 可以删除、激活和修改遗传密码，就像其较大的对应物一样。 其较小的尺寸意味着它应该更容易输送到人体细胞和人体，使其成为治疗各种疾病的潜在工具，包括眼病、器官退化和一般的遗传病。

不断努力

为了使系统尽可能小，研究人员决定从 CRISPR 蛋白 Cas12f（也称为 Cas14）开始，因为它只包含大约 400 到 700 个氨基酸。 然而，与其他 CRISPR 蛋白一样，Cas12f 天然起源于古细菌——单细胞生物——这意味着它完全不适合哺乳动物细胞，更不用说人类细胞或身体了。 已知很少有 CRISPR 蛋白无需修饰即可在哺乳动物细胞中发挥作用。 不幸的是，CAS12f 不是其中之一。 这对于像齐这样的生物工程师来说是一个有吸引力的挑战。

“我们想，‘嗯，数百万年的进化无法将这个 CRISPR 系统转变为在人体中起作用的东西。 我们能在一两年内改变它吗？ “据我所知，我们第一次将无功能的 CRISPR 转换为有效的 CRISPR。”

事实上，齐实验室的博士后研究员、论文的第一作者徐晓舒并没有观察到人体细胞中正常 Cas12f 的任何活动。 Xu 和 Qi 假设问题在于人类基因组 DNA 比微生物 DNA 更复杂且更不易获得，这使得 Cas12f 很难在细胞中找到它的目标。 通过考虑 Cas12f 系统的计算预期结构，它仔细选择了大约 40 个可以绕过这一限制的蛋白质突变，并建立了一个管道来同时测试许多蛋白质变体。 理论上，工作变体将通过激活其基因组中的绿色荧光蛋白 (GFP) 使人类细胞变绿。

“起初，这个系统在一年内根本不起作用，”Shaw 说。 “但在生物工程迭代之后，我们看到一些工程蛋白质开始发挥作用，就像魔法一样。这真的让我们意识到合成生物学和生物工程的力量。”

第一个成功的结果并不大，但它们让徐振奋并鼓励她继续前进，因为这意味着系统正在运行。 经过许多额外的迭代，我能够提高蛋白质的性能。 “我们开始只看到两个细胞显示绿色信号，现在经过工程改造，几乎每个细胞在显微镜下都是绿色的，”徐说。

“有一次，我不得不阻止它，”Che 回忆道。 “我说，’现在很好。你已经建立了一个很好的系统。我们应该考虑如何在应用中使用这种分子。’”

除了对蛋白质进行工程改造外，研究人员还设计了 核糖核酸 它将 Cas 蛋白引导至目标 DNA。 要使 CasMINI 系统在人体细胞中发挥作用，必须对这两个组件进行修改。 他们测试了 CasMINI 在实验室依赖的人类细胞中删除和编辑基因的能力，包括与 HIV 感染、抗肿瘤免疫反应和贫血相关的基因。 它对他们测试的几乎每个基因都起作用，对许多基因都有强烈的反应。

开门

研究人员已经开始与其他科学家合作寻求基因疗法。 他们还对它如何促进 RNA 技术的进步感兴趣——例如用于开发 mRNA 的技术 新冠肺炎 疫苗 – 大小也可能是一个限制因素。

“自 CRISPR 早期以来，该领域就需要这种设计这些系统的能力，我觉得我们已经为实现这一目标做出了自己的贡献，”齐说。 这种工程方法非常有益。 这就是让我兴奋的地方——打开通往新可能性的大门。”

参考：“用于哺乳动物基因组调控和编辑的 CRISPR-Cas 微型系统”，作者：Xiaoshu Xu、Augustine Chemparathy、Leiping Zeng、Hannah R. Kempton、Stephen Shang、Muneaki Nakamura 和 Lei S. Qi，2021 年 9 月 3 日， 分子细胞.
doi：10.1016/j.molcel.2021.08.008

该论文的其他斯坦福大学合著者是研究生 Augustine Chimbarathy 和 Hana Kimpton，以及博士后 Liping Zheng、Stephen Chang 和 Munyaki Nakamura。 Qi 也是斯坦福 Bio-X 的成员。 母婴健康研究所（MCHRI）、斯坦福癌症研究所和吴仔神经科学研究所。 该研究由李嘉诚基金会资助。